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本试剂盒是用于测定活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。CCK-8实验的灵敏度比其它如MTT、XTT或MTS高。由于本制品相当稳定，并且对细胞没有毒性，可直接加入到细胞样品中长时间孵育。

1. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。
   
2. CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。由于不同细胞的显色程度不一致，首次实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
   
3. 一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量(约1×10⁵个细胞/孔)。悬浮细胞比贴壁细胞难显色。在加入CCK-8培养1～4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确认。
   
4. 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8检测溶液在450nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8检测溶液，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100μL培养基和10μL CCK-8溶液进行检测。
   
5. 用酶标仪检测前请确保孔内没有气泡，否则会干扰测定。
   
6. 如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600nm(或600nm以上)作为参比波长，扣除参比波长的OD值即可。
   
7. 含有酚红的培养基不影响CCK-8做细胞活性的测定，但需要在结果计算时，扣除空白孔的本底值。
   
8. 孵育2小时后，空白孔O.D.值一般为0.1-0.2单位。
   
9. CCK-8可用于大肠杆菌的检测，但不能用于酵母细胞。
   
10. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。
    
11. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK-8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。
    
12. 为保证您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 针对细胞活性检测
   
   1. 96孔板加入细胞100μL/孔(约1×10⁴)，置37℃ 5% CO₂细胞培养箱培养24小时。
      
   2. 向各孔中加入10μL的CCK-8检测溶液。
      注：不要引入气泡，以免干扰OD值检测。
      
   3. 37℃下孵育1～4小时。(注：CCK-8的最佳反应时间以细胞具体显色程度为准)
      
   4. 读数前可在摇床上温柔混匀，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光度。
2. 针对细胞增殖/毒性检测
   
   1. 96孔板加入细胞100μL/孔(约1×10⁴)，置37℃ 5%CO₂细胞培养箱培养24小时。
      
   2. 加入适当浓度的受试化合物。
      
   3. 将96孔板在37℃，含5% CO₂空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。
      注：时间可设置为6,12,24,48h等。
      
   4. 向各孔中加入10μL的CCK-8检测溶液。
      注：不要引入气泡，以免干扰OD值检测。
      
   5. 37℃下孵育1～4小时。
      注：CCK-8的最佳反应时间以细胞具体显色程度为准。
      
   6. 读数前可在摇床上温柔混匀，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光度。
      注：如果不能立刻测量吸光度，可将培养板置于4℃冰箱，或每个孔中加入10μL 1％w/v SDS或0.1M HCl，盖好并在室温下避光保存。24小时内检测。
3. 结果分析
   您可以选择使用O.D.值或细胞数量来进行结果分析，我们提供以下方法供参考。
   
   1. 细胞存活率(％)= [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100
      抑制率(％)= [(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100
      注：各重复孔的OD值取均数±SD。
      As =实验孔吸光度(含有细胞，培养基，CCK-8和受试化合物的孔的吸光度)
      Ab =空白孔吸光度(含有培养基和CCK-8的孔的吸光度)
      Ac =对照孔吸光度(含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度)
      
   2. 抑制率= 50%时的药物浓度(IC50)及抑制率= 10%时的药物浓度(IC90)。
4. 制作标准曲线
   可以基于该曲线确定待测样品的细胞数，使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件一致。
   
   1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数，接种细胞。
      
   2. 使用培养基等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5～7个浓度梯度，每组3个复孔。然后接种细胞。(注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。)
      
   3. 培养直至细胞贴壁(通常2～4小时)，然后每100μL培养基加入10μL CCK-8。继续孵育1～4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。